Двоверижна РНК (dsRNA) КОМПЛЕТ ELISA

Овој комплет е Ензимско-поврзана имуносорбентна анализа (ELISA) спојување со биотин-стрептавидин систем, за квантитативно мерење на dsRNA со должина над 60 базни парови (bp), без оглед на секвенцата.Плочата е претходно обложена со анти-dsRNA антитела.dsRNA присутна во примерокот се додава и се врзува за антителата обложени на бунарите.А потоа се додава биотинилизирано анти-dsRNA антитело и се врзува за dsRNA во примерокот.По миењето, HRP-Streptavidin се додава и се врзува за биотинилираното анти-dsRNA антитело.По инкубацијата, неврзаниот HRP-Streptavidin се измива.Потоа се додава раствор на супстрат TMB и се катализира со HRP за да се добие производ во сина боја кој се смени во жолта по додавање на кисел стоп раствор.Густината на жолтата е пропорционална со целната количина на dsRNA заробена во плочата.Апсорпцијата се мери на 450 nm.

Апликација

Овој комплет е за квантитативно мерење на резидуалната dsRNA.

Компоненти на комплетот

Складирање и стабилност

1. За неискористен комплет: Целиот комплет може да се чува на 2~8℃ во рок на траење.За стабилност на складирањето треба да се избегнува силна светлина.

2. За користен комплет: Откако ќе се отвори микроплочката, покријте ги неискористените бунари со запечатувач на плочи и вратете се во фолиената торбичка што го содржи пакетот за сушење, затворете ја фолијата торбичка со патент и вратете ја на 2~8℃ што е можно поскоро по употребата.Другите реагенси треба да се вратат на 2~8℃ што е можно поскоро по употребата.

Потребни материјали, но не се испорачуваат

1. Читач на микроплоча со филтер од 450±10 nm (подобро ако може да открие на бранова должина од 450 и 650 nm).

2. Шејкер за микроплоча.

3. Врвови без RNase и цевки за центрифугирање.

Операција дијаграм на текови

Пред да почнеш

1. Доведете ги сите компоненти и примероци од комплетот на собна температура (18-25℃) пред употреба.Ако комплетот нема да се потроши едно време, извадете ги само лентите и реагенсите за сегашниот експеримент и оставете ги преостанатите ленти и реагенси во потребната состојба.

2. Пуфер за миење: разредете 40 ml од 20× концентриран пуфер за миење со 760 ml дејонизирана или дестилирана вода за да подготвите 800 ml од 1× пуфер за миење.

3. Стандардно: накратко завртете го или центрифугирајте го основниот раствор пред употреба.Концентрацијата на четири дадени стандарди е 5ng/μL.За стандардите за UTP и pUTP dsRNA, разредете го основниот раствор на 1,0,5,0,25,0,125,0,0625,0,0312,0,0156,0 pg/μL со STE пуфер за да се нацрта стандардната крива.За N1-Me-pUTP dsRNA стандардите, ве молиме разредете го основниот раствор на 2,1,0,5,0,25,0,125,0,0625,0,0312, 0pg/μL со STE пуфер за да се нацрта стандардната крива.За 5-OMe-UTP dsRNA стандард, ве молиме разредете го основниот раствор на 4,2,1,0,5, 0,25,0,125,0,0625, 0 pg/μL со STE пуфер за да се нацрта стандардната крива.Препорачуваме дека стандардите може да се разредат на следниве графикони:

4. Биотинилирани антитела за откривање и HRP-стрептавидин работен раствор: накратко завртете го или центрифугирајте го основниот раствор пред употреба.Разредете ги до работната концентрација со пуфер за разредување.

5. TMB подлога: аспирирајте ја потребната доза од растворот со стерилизирани врвови и не фрлајте го преостанатиот раствор повторно во вијалата.TMB подлогата е чувствителна на светлина, не ја изложувајте TMB подлогата на светлина долго време.

Користење на протокол

1. Определете го бројот на ленти потребни за анализата.Вметнете ги лентите во рамките за употреба.Преостанатите ленти на плочи кои не се користат во оваа анализа треба да се пакуваат во кеса со средство за сушење.Добро затворете ја кесата за складирање во фрижидер.

2. Додадете по 100 μL секое од разредувањето на стандардните, празните и примероците во соодветните бунари.Покријте со запечатувач на чинии.Инкубирајте 1 час на собна температура со тресење на 500 вртежи во минута.Примероците треба да се разредат со STE пуфер до соодветна концентрација за точна анализа.

3. Чекор на миење: Аспирирајте го растворот и измијте со 250 μL пуфер за миење до секоја бунар и оставете го да отстои 30 секунди.Целосно исфрлете го пуферот за миење така што ќе ја прикачите плочата на впивачка хартија.Целосно се мие 4 пати.

4. Додадете 100 μL работен раствор на биотинилиран антитела за детекција во секоја бунар.Покријте со запечатувач на чинии.Инкубирајте 1 час на собна температура со тресење на 500 вртежи во минута.

5. Повторете го чекорот за миење.

6. Додадете 100 μL работен раствор на HRP-стрептавидин во секој бунар.Покријте со запечатувач на чинии.Инкубирајте 30 мин на собна температура со тресење на 500 вртежи во минута.

7. Повторете го чекорот на миење повторно.

8. Додадете 100 μL раствор на супстрат TMB во секоја бунар.Покријте со запечатувач на чинии.Инкубирајте 30 мин на RT Заштитете од светлина.Течноста ќе стане сина со додавање на раствор на подлогата.

9. Додадете 50 μL стоп раствор во секоја бунар.Течноста ќе стане жолта со додавање на стоп раствор.Потоа вклучете го читачот на микроплочи и веднаш спроведете мерење на 450 nm.

Пресметка на резултати

1. Просек на дупликат отчитувања за секој стандард, контрола и примероци и одземете ја просечната нула стандардна оптичка густина.Конструирај стандардна крива со апсорпција на вертикалната (Y) оска и концентрација на dsRNA на хоризонталната (X) оска.

2. Препорачливо е да се изврши пресметката со компјутерски софтвер за фитинг на криви, како што е кривата експерт 1.3 или ELISA Calc во модел со нелинеарно вклопување со 5 или 4 параметри.

Изведба

1. Чувствителност:

долна граница на откривање: ≤ 0,001 pg/μL (за UTP-, pUTP-, N1-Me-pUTP-dsRNA), ≤ 0,01 pg/μL (за 5-OMe-UTP-dsRNA).

долна граница на квантитација: 0,0156 pg/μL (за UTP-, pUTP-dsRNA), 0,0312 pg/μL (за N1-Me-pUTP-dsRNA), 0,0625 pg/μL (за 5-OMe-UTP-dsRNA).

2. Прецизност: CV на интра-анализа ≤10%, CV на интер-анализа ≤10%

3. Обнова:80%~120%

4. Линеарност: 0,0156-0,5 pg/μL (заUTP-, pUTP-dsRNA) 0,0312-1 pg/μL (за N1-Me-pUTP dsRNA), 0,0625-1 pg/μL (за 5-OMe-UTP-dsRNA).

Размислувања

1. Температурата и времето на реакција на TMB се критични, ве молиме контролирајте ги строго според инструкциите.

2. За да се постигне добра репродуктивност и чувствителност на анализата, неопходно е правилно миење на плочите за да се отстрани вишокот на реагенси кои не реагирале.

3. Сите реагенси треба темелно да се измешаат пред употреба и да се избегнуваат удари при додавање примерок или реагенси.

4. Ако во концентрираниот пуфер за миење се формирале кристали (20x), загрејте до 37℃ и нежно мешајте додека кристалите целосно не се растворат.

5. Избегнувајте анализа на примероци кои содржат натриум азид (NaN3), бидејќи може да ја уништи активноста на HRP што резултира со потценување на количината на dsRNA.

6. Избегнувајте контаминација со RNase за време на анализата.

7. Стандардот/примерокот, антителата за откривање и SA-HRP исто така може да се спроведат на RT без тресење, но тоа може да предизвика намалување на чувствителноста на детекцијата за еднократно.За овој случај, препорачуваме UTP и pUTP dsRNA стандардите да се разредуваат од 2 pg/μL, N1-Me-pUTP dsRNA стандардите треба да се разредат од 4 pg/μL и 5-OMe-UTP dsRNA стандардот да се разреди од 8 pg/μL.Дополнително, инкубирајте HRP-стрептавидин работен раствор 60 минути на собна температура.Не користете шејкер за колба, бидејќи шејкерот за колба може да резултира со неточен резултат.

Типичен резултат

1. Стандардни податоци за кривата

2. Стандардна пресметка на кривата

3. Опсег на откривање на лагер:0,0312- 1pg/μL