mRNA Кап2'-О-Метилтрансфераза
mRNA Cap 2' -O-methyltransferase е изведена од рекомбинантен сој на E. coli што го носи генот за mRNA Cap 2'-O-Methyltransferase на вакцини.Овој ензим додава метил група на позицијата 2'-O на првиот нуклеотид во непосредна близина на структурата на капа на 5' крајот на РНК. -0) што резултира со капа- 1 структура.
Структурата Cap1 може да ја зголеми ефикасноста на транслацијата, подобрувајќи ја експресијата на mRNA во експериментите со трансфекција и микроинјекција. Овој ензим конкретно бара РНК со капаче m7GpppN како супстрат.Не може да користи РНК со pN, ppN, pppN или GpppN на 5' крајот.Капаната РНК може да се подготви преку ин витро транскрипција со користење на аналогни капа или преку ензимско затварање со користење на ензимот за покривање на Vaccinia.
Компоненти
mRNA капа 2'-O-Метилтрансфераза (50U/μL)
10×Купирање на тампон за реакција
Складирање
-25 ～- 15 ℃ за складирање (Избегнувајте повторени циклуси на замрзнување-одмрзнување)
Бафер за складирање
20 mM Tris-HCl (pH 8,0, 25℃), 100 mM NaCl, 1 mM DTT, 0, 1 mM EDTA, 0, 1% Triton X-100, 50% глицерол.
Дефиниција на единица
Една единица е дефинирана како количина на ензим потребен за метилација на 10 pmoles од 80 nt препис на РНК за 1 час на 37°C.
Анализи за контрола на квалитетот
Егзонуклеаза:50 U mRNA Cap 2' -O-Methyltransferase со 1μg λ-Hind III дигест ДНК на 37 ℃ во текот на 16 часа не дава разградување како што е определено со електрофореза со гел агароза.
Ендонуклеаза: 50 U mRNA Кап 2' -O-Метилтрансфераза со 1 μg λDNA на 37℃ во тек на 16 часа не дава разградување како што е определено со електрофореза на гел агароза.
Никасе: 50 U mRNA Cap 2' -O-Methyltransferase со 1μg pBR322 на 37 ℃ за 16 часа не дава разградување како што е определено со електрофореза на гел агароза.
RNase: 50 U mRNA Cap 2' -O-Methyltransferase со 1,6μg MS2 RNA за 4 часа на 37℃ не дава разградување како што е определено со електрофореза на гел агароза.
E. коли ДНК: 50 U од mRNA Кап 2' -О-Метилтрансфераза се испитува за присуство наE. коли геномска ДНК користејќи TaqMan qPCR со прајмери специфични заE. коли 16S rRNA локус.НаE. коли геномската ДНК контаминација е =1E. коли геном.
Бактериски Ендотоксин: LAL-тест, според кинеската фармакопеја IV 2020 издание, метод за тестирање на граница на гел, општо правило (1143).Содржината на бактериски ендотоксин треба да биде =10 ЕУ/мг.
Систем и услови за реакција
1. Комбинирајте соодветно количество на покриена RNA и H2O без RN-аза во микрофугарска цевка од 1,5 mL до конечен волумен од 16,0 µL.
2. Загрејте на 65℃ 5 минути проследено со ледена бања 5 минути.
3. Додадете ги следните компоненти по наведениот редослед (за метилација на Caped RNA
помалку од 10
| Компонента | Волумен |
| Денатурирана затворена РНК | 16 μL |
| 10X тампон за реакција на ограничување* | 2 μL |
| SAM (4 mM) | 1 μL |
| mRNA капа 2'-O-Метилтрансфераза (50 U/μL) | 1 μL |
| ddH2O | До 20 μL |
*10× Пуфер за реакција на покривање: 500 mM Tris-HCl (pH 8,0, 25℃), 50 mM KCl, 10 mM MgCl2 、 10 mM DTT.
4. Инкубирајте на 37℃ 1 час (се препорачуваат 2 часа инкубација за целниот фрагмент помал од 200 nt).
Апликации
Да се подобри изразот на mRNA за време на експериментите со микроинјекција и трансфекција.
Забелешки за употреба
1. Пред реакцијата, РНК треба да се прочисти и раствори во вода без нуклеаза, сите раствори не треба да содржат никакви EDTA и јони.
2. Се препорачува да се загрее примерокот РНК на 65℃ 5 мин пред реакцијата за да се отстрани секундарната структура на 5' крајот од транскриптот.Може да се продолжи до 10 мин за сложена 5'-терминална структура.
