PNG-аза F
Пептид-N-гликозидаза F(PNGаза F) е најефективниот ензимски метод за отстранување на речиси сите N-поврзани олигосахариди од гликопротеините.PNGase F е амидаза, која се расцепува помеѓу внатрешните повеќето GlcNAc и аспарагински остатоци од висока маноза, хибридни и сложени олигосахариди од N-поврзани гликопротеини.
Апликација
Овој ензим е корисен за отстранување на остатоците од јаглени хидрати од протеините.
Подготовка и спецификација
| Изглед | Безбојна течност |
| Чистота на протеинот | ≥95% (од SDS-PAGE) |
| Активност | ≥500.000 U/mL |
| Егзогликозидаза | Не можеше да се открие никаква активност (ND) |
| Ендогликозидаза F1 | ND |
| Ендогликозидаза F2 | ND |
| Ендогликозидаза F3 | ND |
| Ендогликозидаза H | ND |
| Протеаза | ND |
Својства
| EC број | 3.5.1.52(Рекомбинант од микроорганизам) |
| Молекуларна тежина | 35 kDa (SDS-PAGE) |
| Изоелектрична точка | 8. 14 |
| Оптимална pH вредност | 7,0-8,0 |
| Оптимална температура | 65 °C |
| Специфичност на подлогата | Раскинување на гликозидни врски помеѓу остатоците од GlcNAc и аспарагин Сл.1 |
| Сајтови за препознавање | N-поврзани гликани освен ако не содржат α1-3 фукоза Сл. 2 |
| Активатори | ДТТ |
| Инхибитор | СДС |
| Температура на складирање | -25 ~ -15 ℃ |
| Деактивирање на топлина | Реакционата смеса од 20 µL што содржи 1 µL PNGase F се инактивира со инкубација на 75 °C за 10 минути. |
Сл. 1 Специфичност на супстратот на PNGase F
Сл. 2 Препознавање се наоѓа на PNGase F.
Кога внатрешните остатоци од GlcNAc се поврзани со α1-3 фукоза, PNGазата F не може да ги расцепи N-поврзаните олигосахариди од гликопротеините.Оваа модификација е вообичаена кај растенијата и кај некои гликопротеини од инсекти.
Cкомпоненти
|
| Компоненти | Концентрација |
| 1 | PNG-аза F | 50 µl |
| 2 | 10× Гликопротеин денатурирачки пуфер | 1000 µl |
| 3 | 10×ГликоБуфер 2 | 1000 µl |
| 4 | 10% НП-40 | 1000 µl |
Дефиниција на единица
Една единица(U) е дефинирана како количина на ензим потребна за отстранување >95% од јаглехидратите од 10 µg денатурирана RNase B за 1 час на 37°C во вкупен волумен на реакција од 10 µL.
Услови за реакција
1. Растворете 1-20 µg гликопротеин со дејонизирана вода, додадете 1 µl 10×Гликопротеински пуфер за денатурирање и H2O (ако е потребно) за да се добие вкупен волумен на реакција од 10 µl.
2.Инкубирајте на 100°C 10 минути, изладете го на мраз.
3.Додадете 2 µl 10×GlycoBuffer 2, 2 µl 10% NP-40 и измешајте.
4.Додадете 1-2 µl PNGase F и H2O (ако е потребно) за да се направи вкупен волумен на реакција од 20 µl и се меша.
5.Инкубирајте ја реакцијата на 37°C 60 мин.
6.За SDS-PAGE анализа или HPLC анализа.
