Ензим за покривање на вирусот на вакцинија

Ензимот за покривање на вирусот Vaccinia е изведен од рекомбинантен сој на E. coli кој ги носи гените за ензимот за покривање Vaccinia.Овој единствен ензим е составен од две подединици (D1 и D12) и има три ензимски активности (РНК трифосфатаза и гванилилтрансфераза од подединицата D1 и гванин метилтрансфераза од подединицата D12).Ензимот за покривање на вирусот на вакцинија е ефикасен да го катализира формирањето на структурата на капа, која може конкретно да ја прикачи структурата на капачето од 7-метилгуанилат (m7Gppp, капа 0) на 5' крајот на РНК.Структурата на капа (Cap 0) игра важна улога во стабилизацијата на mRNA, транспортот и транслацијата кај еукариотите.Капирање на РНК со ензимска реакција е ефективен и едноставен метод кој може значително да ја подобри стабилноста и транслацијата на РНК за ин витро транскрипција, трансфекција и микроинјекција.

Компоненти

Ензим за покривање на вирусот на вакцинија (10 U/μL)

10×Купирање тампон

Услови за складирање

-25-15℃ за складирање (Избегнувајте повторени циклуси на замрзнување-одмрзнување)

Бафер за складирање

20 mM Tris-HCl (pH 8,0), 100 mM NaCl,

1mM DTT, 0. 1mM EDTA, 0. 1% Triton X- 100, 50% глицерол.

Дефиниција на единицата

Една единица ензим за покривање на вирусот Вакцинија е дефинирана како количина на ензим потребна за инкорпорирање на 10 pmol GTP во транскрипт од 80 nt за 1 час на 37°C.

Контрола на квалитет

Егзонуклеаза:10 U од ензимот за покривање на вирусот Vaccinia со 1μg λ-Hind III дигест ДНК на 37 ℃ за 16 часа не дава разградување како што е утврдено со електрофореза со гел агароза.

Ендонуклеаза:10 U од ензимот за покривање на вирусот Vaccinia со 1μg λDNA на 37℃ за 16 часа не дава разградување како што е утврдено со електрофореза со гел агароза.

Никаза:10 U ензим за покривање на вирусот Vaccinia со 1 μg pBR322 на 37 ℃ во текот на 16 часа не дава разградување како што е утврдено со електрофореза со гел агароза.

RNase:10 U од ензимот за покривање на вирусот Vaccinia со 1,6 μg MS2 RNA за 4 часа на 37 ℃ не дава разградување како што е утврдено со електрофореза со гел агароза.

1.coli ДНК:10 U од ензимот за покривање на вирусот Vaccinia се проверува за присуство на геномска ДНК на E. coli со користење на TaqMan qPCR со прајмери ​​специфични за локусот на E. coli 16S rRNA.Контаминацијата на геномската ДНК на E. coli е ≤1 геном на E. coli.

2.Бактериски Ендотоксин: LAL-тест, според кинеската фармакопеја IV 2020 издание, метод за тестирање на граница на гел, општо правило (1143).Содржината на бактериски ендотоксин треба да биде ≤10 EU/mg.

Систем и услови за реакција

1. Протокол за покривање (волумен на реакција: 20 μL)

Оваа постапка е применлива за реакцијата на покривање од 10μg RNA (≥100 nt) и може да се зголеми според експерименталните барања.

I) Комбинирајте 10 μg РНК и H2O без нуклеаза во микрофуга од 1,5 ml до конечен волумен од 15,0 µL.* 10 × Пуфер за покривање: 0,5 M Tris-HCl, 50 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, (25℃, pH 8,0)

2) Загрејте на 65℃ 5 минути проследено со ледена бања 5 минути.

3) Додадете ги следните компоненти по наведениот редослед

* 10 × Пуфер за покривање: 0,5 M Tris-HCl, 50 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, (25℃, pH8,0)

4) Инкубирајте на 37°C 30 минути, РНК сега е затворена и подготвена за примена низводно.

2. 5′ терминал реакција на етикетирање (волумен на реакција: 20 μL)

Овој протокол е дизајниран да означува РНК што содржи 5' трифосфат и може да се зголеми според барањата.Ефикасноста на инкорпорирањето на етикетата ќе биде под влијание на моларниот сооднос на РНК: GTP, како и содржината на GTP во примероците на РНК.

1) Комбинирајте соодветно количество РНК и H2O без нуклеаза во туба за микрофуга од 1,5 ml до конечен волумен од 14,0 µL.

2) Загрејте на 65℃ 5 минути проследено со ледена бања 5 минути.

3) Додадете ги следните компоненти по наведениот редослед.

** GTP MIX се однесува на GTP и мал број маркери.За концентрацијата на GTP, погледнетена Забелешка 3.

4) Инкубирајте на 37°C 30 минути, крајот на RNA 5' сега е означен и подготвен за низводно

Апликации

1. Капирање на mRNA пред анализи на транслација/ин витро транслација

2. Означување на 5' крајот на mRNA

Забелешки за употреба

1.Загревањето на растворот на РНК пред инкубацијата со ензимот за покривање на Vaccinia ја отстранува секундарната структура на 5' крајот на транскриптот.Продолжете го времето до 60 минути за транскрипти со познати високо структурирани 5'краеви.

2. РНК што се користи за реакции на покривање треба да се прочисти пред употреба и да се суспендира во вода без нуклеаза.EDTA не треба да биде присутен и растворот треба да биде без соли.

3. За означување на 5' крајот, вкупната концентрација на GTP треба да биде околу 1-3 пати поголема од моларната концентрација на mRNA во реакцијата.

4. Волуменот на системот за реакција може да се намали нагоре или надолу во согласност со реалните.