Урацил ДНК гликозилаза
Урацил-ДНК гликозилазата (UNG или UDG) е рекомбинантен клон на E.coli со молекуларна тежина од 25 kDa.Го катализира ослободувањето на слободен урацил од едноверижна и двоверижна ДНК што содржи урацил и е неактивен против РНК и може да се користи за да се спречи контаминација на производите за засилување на PCR.Принципот на дејство се заснова на фактот дека ако dUTP се замени за dTTP во PCR реакцијата и се формира производ за засилување на PCR кој содржи dU бази, ензимот може селективно да ја раскине гликозидната врска на U базите во едноверижни и двоверижни. ДНК и го разградуваат производот за засилување на PCR.
Препорачана апликација
Засилување за спречување на контаминација
Состојба на чување
-20°C за долгорочно складирање, треба добро да се измеша пред употреба, избегнувајте често замрзнување-одмрзнување.
Бафер за складирање
20 mM Tris-HCl (pH 8,0), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, стабилизатор, 50% глицерол.
Дефиниција на единицата
Количината на ензимот потребна за разградување на 1 µg едноверижна ДНК која содржи dU бази за 1 час на 37°C е 1 единица.
Контрола на квалитет
1.SDS-PAGE електрофоретска чистота поголема од 98%
2.Чувствителност на засилување, контрола од серија во серија, стабилност
3.Откако 1U UNG се третира на 50℃ за 2 минути, шаблонот што содржи U под 103 копии треба целосно да се деградира и да не може да се произведе производ за засилување
4.Нема егзогена активност на нуклеаза
Инструкции
| Компоненти | Волумен (μL) | Конечна концентрација |
| 10 × PCR пуфер (без dNTP, Mg²+бесплатно) | 5 | 1× |
| dUTPs (dCTP, dGTP, dATP) | - | 200 μM |
| dUTP (замени dTTP) | - | 200-600 μM |
| 25 mM MgCl2 | 2-8 μL | 1-4 mM |
| 5 U/μL Так | 0,25 | 1,25 U |
| 5 U/μL UNG | 0,25 (0,1-0,5) | 0,25 U (0,1-0,5) |
| 25 × Мешавина за прајмера | 2 | 1× |
| Шаблон | - | ＜1μg/реакција |
| ddH2O | До 50 | - |
Забелешка: a: Ако се користи за qPCR/qRT-PCR, флуоресцентната сонда треба да се додаде во системот за реакција.Обично, конечната концентрација на прајмер од 0,2 μM може да даде добри резултати;кога перформансите на реакцијата се слаби, концентрацијата на прајмерот може да се прилагоди во опсег од 0,2-1 μM.Обично, концентрацијата на сондата е оптимизирана во опсег од 0,1-0,3 μM.Може да се изведат експерименти со концентрационен градиент за да се најде најдобрата комбинација на прајмер и сонда.
Белешки
1.Ензимот UNG може да се користи за отстранување на контаминираните производи за засилување dUTP од системот за реакција пред реакцијата за засилување на PCR, а потоа за да се избегнат лажно-позитивни резултати поради контаминација на производот.
2.Оптималната температура за UNG ензимот што треба да се користи во PCR реакцијата против контаминација е генерално 50 ° C за 2 минути;состојбата на инактивација е 95℃ за 5 минути.
3.Избегнувајте често замрзнување-одмрзнување и не изложувајте се на големи температурни флуктуации.
4.Различните гени што треба да се засилуваат имаат различна ефикасност на користење на dUTP и чувствителност на ензимот UNG, затоа, ако употребата на системот UNG доведе до намалување на чувствителноста на откривање, системот за реакција треба да се прилагоди и оптимизира, доколку ви треба техничка поддршка, ве молиме контактирајте нашата компанија.
