M-MLV Neoscript Reverse Transcriptase
Неоскрипт реверзна транскриптаза е реверзна транскриптаза добиена со мутациски скрининг на M-MLV генот на потеклото и изразувањето на вирусот на леукемија на глувчето Moloney во E.coli.Ензимот ја отстранува активноста на RNase H, има поголема толеранција на температурата и е погоден за обратна транскрипција на висока температура.Затоа, тој е корисен за елиминирање на неповолните ефекти на структурата на високо ниво на РНК и неспецифичните фактори врз синтезата на cDNA и има поголема стабилност и способност за синтеза на обратна транскрипција.Ензимот има поголема стабилност и способност за синтеза на обратна транскрипција.
Компоненти
1.200 U/μL Neoscript обратна транскриптаза
2.5 × тампон со прво влакно (опционално)
* 5 × тампон од првата нишка не содржи dNTP, ве молиме додадете dNTP при подготовка на системот за реакција
Препорачана апликација
1.QRT-PCR во еден чекор.
2.Откривање на РНК вирус.
Состојба на чување
-20°C за долгорочно складирање, треба добро да се измеша пред употреба, избегнувајте често замрзнување-одмрзнување.
Дефиниција на единицата
Една единица вклучува 1 nmol dTTP за 10 минути на 37°C користејќи поли(A)•oligo(dT)25како шаблон/прајмер.
Контрола на квалитет
1.SDS-PAGE електрофоретска чистота поголема од 98%.
2.Чувствителност на засилување, контрола од серија во серија, стабилност.
3.Нема егзогена нуклеазна активност, нема егзогена ендонуклеаза или контаминација со егзонуклеаза
Поставување реакција за решение за прва верижна реакција
1.Подготовка на реакционата смеса
| Компоненти | Волумен |
| Олиго (dT)12-18 Прајмер или Случаен прајмера Или генски специфични прајмериb | 50 pmol |
| 50 pmol (20-100 pmol) | |
| 2 pmol | |
| 10 mM dNTP | 1 μL |
| Шаблон РНК | Вкупна РНК≤ 5μg;mRNA≤ 1 μg |
| dH без RNase2O | До 10 μL |
Белешки:a/b: Ве молиме изберете различни типови на прајмери според вашите експериментални потреби.
2.Загрејте на 65°C 5 минути и брзо ладете на мраз 2 минути.
3.Додадете ги следните компоненти во горенаведениот систем до вкупен волумен од 20 µL и нежно измешајте:
| Компоненти | Волумен (μL) |
| 5 × тампон со прво влакно | 4 |
| Неоскрипт реверзна транскриптаза (200 U/μL) | 1 |
| Инхибитор на RNase (40 U/μL) | 1 |
| dH без RNase2O | До 20 μL |
4. Ве молиме изведете ја реакцијата според следниве услови:
(1) Ако се користи случаен прајмер, реакцијата треба да се изврши на 25℃ за 10 минути, а потоа на 50℃ за 30-60 минути;
(2) Ако се користат Oligo dT или специфични прајмери, реакцијата треба да се спроведе на 50℃ за 30-60 минути.
5.Загрејте на 95℃ 5 минути за да ја деактивирате Neoscript Reverse Transcriptase и да ја прекинете реакцијата.
6.Производите за обратна транскрипција може да се користат директно во PCR реакција и флуоресцентна квантитативна PCR реакција, или да се чуваат на -20℃ долго време.
PCR Ракција:
1.Подготовка на реакционата смеса
| Компоненти | Концентрација |
| 10 × PCR пуфер (без dNTP, без Mg²+) | 1× |
| dNTP (10mM секој dNTP) | 200 μM |
| 25 mM MgCl2 | 1-4 mM |
| Taq DNA полимераза (5U/μL) | 2-2,5 U |
| Прајмер 1 (10 μM) | 0,2-1 μM |
| Прајмер 2 (10 μM) | 0,2-1 μM |
| Шаблона | ≤10% раствор за прва верижна реакција (2 μL) |
| ddH2O | До 50 μL |
Белешки:a: Ако се додаде премногу раствор од првата верижна реакција, PCR реакцијата може да биде инхибирана.
2.Постапка за реакција на PCR
| Чекор | Температура | Време | Циклуси |
| Пред денатурација | 95 ℃ | 2-5 мин | 1 |
| Денатурација | 95 ℃ | 10-20 сек | 30-40 |
| Греење | 50-60 ℃ | 10-30 сек | |
| Продолжување | 72 ℃ | 10-60 сек |
Белешки
1.Погоден за оптимизација на температурата на обратна транскрипција во опсег од 42℃~55℃.
2.Има подобра стабилност, погоден е за засилување на обратна транскрипција на високи температури.Покрај тоа, тој е поволен за ефикасно минување низ сложените структурни региони на РНК.Исто така, тоае погоден за едностепено мултиплекс флуоресценција квантитативно RT-PCR детекција.
3.Добра компатибилност со различни ензими за засилување на PCR и е погоден за RT-PCR реакции со висока чувствителност.
4.Погоден за висока чувствителност во едностепена флуоресценција квантитативна RT-PCR реакција, ефикасно ја подобрува стапката на откривање на ниска концентрација на шаблони.
5.Погоден за изградба на библиотека cDNA.
