Рназа инхибитор
Инхибитор на глувчешка RNase е рекомбинантен инхибитор на RNase на глувчето изразен и прочистен од E.coli.Се врзува за RNase A, B или C во сооднос 1:1 преку нековалентно поврзување, а со тоа ја инхибира активноста на трите ензими и ја штити РНК од деградација.Сепак, не е ефикасен против RNase 1, RNase T1, S1 Nuclease, RNase H или RNase од Aspergillus.Инхибиторот на RNase на глувчето беше тестиран со RT-PCR, RT-qPCR и IVT mRNA и беше компатибилен со различни комерцијални реверзни транскриптази, ДНК полимерази и РНК полимерази.
Во споредба со човечките инхибитори на RNase, инхибиторот на RNase на глувчето не содржи два цистеини кои се високо чувствителни на оксидација што предизвикува инактивација на инхибиторот.Тоа го прави стабилен при ниски концентрации на DTT (помалку од 1 mM).Оваа карактеристика го прави погоден за употреба во реакции каде што високите концентрации на DTT се негативни на реакцијата (на пр. RT-PCR во реално време).
Aапликација
Овој производ може широко да се користи во секој експеримент каде што е можна интерференција на RNase за да се избегне деградација на РНК, како што се:
1.Синтеза на првата нишка на cDNA, RT-PCR, RT-qPCR, итн.
2.Ја заштитува РНК од деградација за време на ин витро транскрипција/преведување (на пр., ин витро систем за репликација на вируси).
3.Инхибиција на активноста на RNase за време на сепарација и прочистување на РНК.
Услови за чување
Производот може да се чува на -25 ~ 15 ℃, со важност 2 години.
Бафер за складирање
50 mM KCl, 20 mM HEPES-KOH (pH 7,6, 25 ℃), 8 mM DTT и 50% глицерол.
Дефиниција на единица
Количината на инхибитор на глувчешка RNase потребна за да се инхибира активноста на 5 ng рибонуклеаза А за 50% беше дефинирана како една единица (U).
Молекуларна тежина на протеини
Молекуларната тежина на инхибиторот на RNase на глувчето е 50 kDa.
Контрола на квалитет
Егзонуклеаза Активност:
40 U од глувчешки RNase инхибитор со 1 μg λ-Hind III дигест ДНК на 37℃ во текот на 16 часа не дава разградување како што е утврдено со електрофореза со гел агароза.
Активност на ендонуклеаза:
40 U од глувчешки RNase инхибитор со 1μg λ ДНК на 37℃ за 16 часа не дава разградување како што е определено со електрофореза на гел агароза.
Никинг Активност:
40 U од глувчешки RNase инхибитор со 1μg pBR322 на 37℃ за 16 часа не дава разградување како што е определено со електрофореза на гел агароза.
RNase Активност:
40 U од глувчешки RNase инхибитор со 1,6μ g MS2 RNA за 4 часа на 37℃ не дава разградување како што е утврдено со електрофореза со гел агароза.
E.coli ДНК:
40 U од инхибиторот на RNase на глувчето се скринираат за присуство на геномска ДНК на E. coli со користење на TaqMan qPCR со прајмери специфични за локусот на E. coli 16S rRNA.Контаминацијата на геномската ДНК на E. coli е ≤ 0,1 pg/40 U.
Nотеs
1. Насилното осцилирање или мешање ќе доведе до инактивација на ензимот.
2. Оптималниот температурен опсег на овој инхибитор беше 25-55 ℃, и беше деактивиран на 65 ℃ и погоре.
3. Активностите на RNase H, RNase 1 и RNase T1 не беа инхибирани со инхибитор на глувчешка RNase.
4. Инхибицијата на активноста на RNase беше пронајдена во широк опсег на pH (pH 5-9 беа сите активни), а највисоката активност беше забележана на pH 7-8.
5. Бидејќи рибонуклеазите обично ја задржуваат активноста во услови на денатурирање, мора да се внимава да се избегне денатурирање на молекулите на инхибиторот на RNase кои се сложени со рибонуклеаза.За да се спречи ослободување на активна рибонуклеаза, треба да се избегнуваат температури поголеми од 50 °C и високи концентрации на уреа или други денатурирачки агенси.
