RTL обратна транскриптаза
RTL реверзната транскриптаза е ДНК полимераза зависна од РНК шаблон на која и недостасува 3'→5' егзонуклеазна активност и има активност на RNase H.Овој ензим може да користи РНК како шаблон за синтеза на комплементарна нишка на ДНК, која може да се примени за синтеза на cDNA на првата нишка, особено за RT-LAMP (изотермално засилување посредувано од јамка).Во споредба со RTL реверзна транскриптаза 1.0, чувствителноста е значително подобрена, термичката стабилност е посилна и реакцијата на 65°C е постабилна.RTL реверзна транскриптаза (без глицерол) може да се користи за подготовка на лиофилизирани препарати, лиофилизирани RT-LAMP реагенси итн.
Дефиниција на единицата
Една единица вклучува 1 nmol dTTP во материјал што може да се таложи со киселина за 20 минути на 50°C користејќи поли(A)•oligo(dT)25 како шаблон-прајмер.
Компоненти
| Компонента | HC5008A-01 | HC5008A-02 | HC5008A-03 |
| RTL реверзна транскриптаза (без глицерол) (15 U/μL) | 0,1 ml | 1 мл | 10 мл |
| 10×HC RTL пуфер | 1,5 мл | 4×1,5 мл | 5×10 ml |
| MgSO4 (100mM) | 1,5 мл | 2×1,5 мл | 3×10 ml |
Состојба на чување
Транспортирајте под 0°C и да се чува на -25°C~-15°C.
Контрола на квалитет
- Резидуална активност наEдонуклеаза:Реакција од 50 μL која содржи 1 μg λDNA и 15 единици RTL2.0 инкубирани 16 часа на 37 ℃ го покажува истиот модел како негативната контрола со гел електрофореза.
- Резидуална активност наЕгзонуклеаза:Реакција од 50 μL која содржи 1 μg дигестија λDNA од Hind Ⅲ и 15 единици RTL2.0 инкубирани 16 часа на 37 ℃ го покажува истиот модел како негативната контрола со гел електрофореза.
- Резидуална активност наНикасе:Реакција од 50 μL која содржи 1 μg супернамотан pBR322 и 15 единици RTL2.0 инкубирани 4 часа на 37°C го покажува истиот модел како негативната контрола со гел електрофореза.
- Резидуална активност наRNase:Реакција од 10 μL која содржи 0,48 μg MS2 RNA и 15 единици RTL2.0 инкубирани 4 часа на 37°C го покажува истиот модел како негативната контрола со гел електрофореза.
- Ешерихија коли gДНК:Измерено соЕшерихија колиспецифични комплети за откривање HCD, 15 единици RTL2.0 содржат помалку од 1Ешерихија колигеном.
Поставување реакција
Протокол за синтеза на cDNA
| Компоненти | Волумен |
| Шаблон РНК а | изборен |
| Олиго (dT) 18~25 (50uM) или Случајна мешавина на прајмер (60uM) | 2 μL |
| dNTP Mix (10mM секоја) | 1 μL |
| Инхибитор на RNase (40 U/uL) | 0,5 μL |
| RTL обратна транскриптаза 2.0 (15 U/uL) | 0,5 μL |
| 10×HC RTL пуфер | 2 μL |
| Вода без нуклеаза | До 20 μL |
Белешки:
1) Препорачаната доза на Вкупно РНК е 1ng~1μg
2) Препорачаната доза на mRNA беше 50ng~100ng
Термо-возење велосипед Услови за рутина реакција:
| Температура (°C) | Време |
| 25 °Ca | 5 мин |
| 55 °C | 10 минb |
| 80 °C | 10 мин |
Белешки:
1) Ако се користи Случајна мешавина на прајмер, чекор на инкубација на 25°C.
2) Ако се користи целна мешавина на прајмер, инкубација на 55°C за 10-30 минути.
RT-LAMP протокол
| Компоненти | Волумен | Конечна концентрација |
| Шаблон РНК | изборен | ≥10 примероци |
| dNTP Mix (10mM) | 3,5 μL | 1,4 mM |
| FIP/BIP прајмери (25×) | 1 μL | 1,6 μM |
| Прајмери F3/B3 (25×) | 1 μL | 0,2 μM |
| LoopF/LoopB Primers (25×) | 1 μL | 0,4 μM |
| Инхибитор на RNase (40 U/μL) | 0,5 μL | 20 U/Реакција |
| RTL реверзна транскриптаза 2.0 (15 U/μL) | 0,5 μL | 7.5 U/реакција |
| Bst V2 ДНК полимераза (8U/μL) | 1 μL | 8 U/Реакција |
| MgSO4 (100mM) | 1,5 μL | 6 mM (вкупно 8 mM) |
| 10×HC RTL пуфер (или 10×HC Bst V2 пуфер) | 2,5 μL | 1 × (2mM Mg2+) |
| Вода без нуклеаза | До 25 μL | - |
Белешки:
1) Измешајте со вртлог и кратко центрифугирајте за да се собере.Инкубација на постојана температура на 65°C за 1 час.
2) Двата бафера се интероперабилни и имаат ист состав.
Белешки
1. Овој производ ќе формира бела цврстина кога се чува на -20 °C.Извадете го од -20°C и ставете го на мраз околу 10 минути.По топењето може да се користи со тресење и мешање.
2. Производот на cDNA може да се чува на -20°C или -80°C или да се користи веднаш за PCR реакција.
3. За да спречите контаминација со RNase, ве молиме чувајте ја експерименталната област чиста и носете чисти ракавици и маски за време на работата.
