Мини комплет за екстракција на ДНК
Овој комплет усвојува оптимизиран пуферски систем и технологија за прочистување на колона од силика гел, која може да поврати 70 bp – 20 kb фрагменти на ДНК од различни концентрации на TAE или TBE агарозен гел.Колоната за адсорпција на ДНК може специјално да ја адсорбира ДНК во услови со висока содржина на сол.Дополнително, комплетот може директно да ги прочисти фрагментите на ДНК од производите на PCR, системи за ензимска реакција или суровите ДНК производи добиени со други методи и да ги отстрани нечистотиите како што се протеините, другите органски соединенија, јоните на неоргански соли и олигонуклеотидните прајмери.Може да обезбеди дека прочистувањето може да заврши во рок од 10-15 мин.Прочистената ДНК може да се користи директно за лигатура, трансформација, ензимско варење, ин витро транскрипција, PCR, секвенционирање, микроинјекција итн.
Услови за складирање
Чувајте го на -15 ~ -25 ℃ и транспортирајте на собна температура.
Компоненти
| Компоненти | (100 rxns) |
| Тампон БДП | 80 мл |
| Бафер GW | 2 × 20 ml |
| Елуционен пуфер | 20 мл |
| FastPure DNA Mini Columns-G | 100 |
Тампон БДП:Пуфер за врзување на ДНК.
Бафер GW:Пуфер за перење;додајте апсолутен етанол според наведениот волумен на шишето пред употреба.
Елуционен пуфер:Елуција.
FastPure DNA Mini Columns-G:Колони за адсорпција на ДНК.
Цевки за колекција 2 ml:Цевки за собирање за филтрат.
Подготвени материјали
1,5 ml стерилизирани цевки, апсолутен етанол и изопропанол (кога фрагментот на ДНК е ≤100 bp, додадете 1 волумен
изопропанол до 1 волумен гел), водена бања.
Процес на експериментирање
Додадете 80 ml етанол за да се разреди Buffer GW како што е наведено на ознаката пред употреба, чувајте го на собна температура.
Механизам
1. Раствор за реакција на PCR
Шема за екстракција на гел: Шема за обновување на растворот за реакција на PCR со бафер со еднаков волумен:Додадете 5 пати поголем бафер за јачина на звук
2. БДП Пресметајте го волуменот на гел (100 μl е еднакво на 100 mg)
Растворете гел
3. Загрејте на 50-55℃
4. Bind Wash
Додадете 300 μL тампон БДП*
Додадете 700 μL пуфер GW
Додадете 700 μL пуфер GW
5. Елутирај
Додадете 20 – 30 μL пуфер за елуција или дејонизирана вода
Забелешки* Обновување на течност за реакција на PCR без овој чекор
Програма за екстракција на гел
1. По ДНК електрофореза за фракционирање на фрагменти на ДНК, исечете ја едната лента на ДНК фрагмент од гелот на агароза под УВ светлина.Се препорачува да се користи абсорбента хартија за да се апсорбира привидната влажност на гелот и да се минимизира големината на парчето гел со отстранување на дополнителна агароза колку што е можно повеќе.Измерете го парчето гел (без цевка за микроцентрифуга) за да го пресметате неговиот волумен: Волуменот на парчето гел од 100 mg е приближно 100 μL, под претпоставка дека густината е 1 g/ml.
2. Додадете еднаков волумен на тампон GDP, инкубирајте на 50~55℃ 7-10 мин (според големината на гелот, прилагодете го времето на инкубација додека гелот целосно не се раствори).Превртете ја цевката 2 пати за време на инкубацијата.
Δ Додавање на 1-3 тома на тампон БДП нема да влијае на ефикасноста на обновувањето на ДНК.Ако фрагментот на ДНК што треба да се врати <100 bp, треба да се додадат 3 тома на тампон БДП;кога парчето гел целосно ќе се раствори, додадете 1 волумен изопропанол и измешајте темелно, а потоа продолжете на следниот чекор.
3. Накратко центрифугирајте за да го доведете примерокот до дното на епруветата, вметнете ги FastPure DNA Mini Columns-G во збирните цевки 2 ml, внимателно префрлете го растворот максимално од 700 μL еднаш на
време до колоните за филтрирање, центрифугирајте на 12.000 вртежи во минута (13.800 X g) 30-60 секунди.
4. Фрлете го филтратот и додадете 300 μL пуфер GDP во колоната, инкубирајте на собна температура 1 мин, центрифугирајте на 12.000 вртежи во минута (13.800 X g) 30-60 секунди.
5. Фрлете го филтратот и додадете 700 μL пуфер GW (проверете дали е однапред додаден апсолутен етанол!) во колоната, центрифугирајте со 12.000 вртежи во минута (13.800 X g) 30-60 секунди.
Δ Ве молиме додадете Buffer GW околу ѕидот на столбот за адсорпција или додадете Buffer GW задниот капак и измешајте го наопаку 2 – 3 пати за да помогнете целосно да се измие солта што се прилепува на ѕидот на цевката.
6. Повторете го чекор 5.
Δ Испирање со пуфер GW двапати може да обезбеди целосно отстранување на солта и да го елиминира влијанието на следните експерименти.
7. Фрлете го филтратот и центрифугирајте ја празната колона со 12.000 вртежи во минута (13.800 X g) 2 мин.
8. Вметнете ја колоната во чиста епрувета со микроцентрифуга од 1,5 ml, додадете 20 - 30 μL пуфер за елуција во центарот на мембраната на колоната, инкубирајте 2 минути и потоа центрифугирајте со 12.000 вртежи во минута (13.800 X g) за 1 мин.Фрлете ја колоната, чувајте ја добиената ДНК на -20 .
Δ Пренесувањето на супернатантот од чекор 8 во колоната за повторно елуирање и претходно загревање на пуферот за елуција до 55 (кога ДНК фрагмент >3 kb) можеби е корисно за зголемување на ефикасноста на обновувањето.
Програма за обновување на PCR производи
Овој протокол е применлив за прочистување на фрагменти на ДНК од PCR производи, систем за ензимска реакција и други сурови производи на ДНК (вклучувајќи генетска ДНК).Овој раствор може ефикасно да отстрани различни нуклеотиди, прајмери, димери на прајмер, молекули на сол, ензими и други нечистотии.
1. Накратко центрифугирајте PCR производи, раствор за ензимска реакција и други сурови производи од ДНК.Проценете го нивниот волумен со пипета и префрлете го во стерилизирана епрувета од 1,5 ml или 2 ml.Додадете ddH2O до волумен до 100 μL;додека за геномска ДНК со висока концентрација, разредувањето до 300 μL со ddH2O ќе помогне да се подобри ефикасноста на обновувањето.
2. Додадете 5 тома на тампон БДП, измешајте темелно со превртување или вртлог.Ако ДНК фрагмент од интерес >100 bp, треба да се додадат дополнителни 1,5 волумени (примероци + тампон GDP) етанол.
3. Вметнете ја колоната назад во цевката за собирање, префрлете ја смесата во колоната, центрифугирајте со 12.000 вртежи во минута (13.800 × g) 30 – 60 секунди.Ако волуменот на измешаниот раствор е >700 µL, вратете ја колоната за адсорпција во собирната цевка, префрлете го преостанатиот раствор во колоната за адсорпција и центрифугирајте на 12.000 вртежи во минута (13.800 × g) 30 – 60 секунди.
4. Следната изведба се однесува на чекорот 5 – 8 од програмата за екстракција 08- 1/Гел.
Апликации
Различни концентрации на TAE или TBE агарозен гел;PCR производи, системи за ензимска реакција или други сурови ДНК производи добиени со различни методи.Обновените фрагменти се движеа од70 bp -20 kb.
Белешки
Само за истражувачка употреба.Не се користи во дијагностички процедури.
1. Додадете 80 ml етанол за да се разреди Buffer GW како што е наведено на ознаката пред употреба, чувајте го на собна температура.
2. Ако баферот БДП лесно се таложи при складирање на ниски температури, може да се стави на собна температура одреден временски период пред употреба.Доколку е потребно, може да се загрее во водена бања на 37℃ додека талогот целосно не се раствори, а потоа може да се користи по мешањето.
3. Однапред поставете ја температурата на водена бања на 50 ~ 55℃.
4. Во чекор 1 на програмата за екстракција 08-1/гел, минимизирањето на големината на парчето гел значително ќе го намали времето на растворање и ќе ја зголеми ефикасноста на обновувањето (линеаризираната ДНК лесно се хидролизира кога постојано се изложува на висока температура).Не изложувајте ДНК гел на УВ долго време, бидејќи ултравиолетовата светлина може да предизвика оштетување на ДНК.
5. Целосно растворете го гелот во чекор 2 од програмата за екстракција на 08- 1/Gel, инаку ефикасноста на обновувањето на ДНК сериозно ќе се наруши.
6. Загрејте го пуферот за елуирање или ddH2O на 55℃, што е корисно за подобрување на ефикасноста на елуцијата на ДНК.Се препорачува складирање на ДНК во елуент од 2,5 mM Tris-HCl, pH 7,0 – 8,5.
