EndoFree плазмид макси комплет
Овој комплет е погоден за екстракција од 150 – 300 ml бактериски раствор култивиран преку ноќ, користејќи подобрена SDS-алкална лиза метода за лизирање на бактериите.Суровиот екстракт селективно се комбинира со уникатен ендотоксин чистач и се одвојува со центрифугирање за да се отстранат ендотоксините.Потоа, мембраната на силика гел селективно се врзува за плазмидната ДНК во растворот во услови на висока сол и ниска pH вредност.Потоа следи додавање пуфер за миење за да се отстранат нечистотиите и другите бактериски компоненти.Конечно, пуфер за елуирање со ниска сол и висока pH се користи за елуирање на чиста плазмидна ДНК од мембраната на силициумската матрица.Мембраната со силика гел користи специјална адсорпциона мембрана, а разликата во количината на адсорпција помеѓу колоната и колоната е многу мала и повторливоста е добра.Не се потребни фенол, хлороформ и други токсични реагенси, а не се потребни ниту чекори за таложење на етанол.Овој комплет може да се користи за брзо екстракција на 0,2-1,5 mg чиста плазмидна ДНК со висока копии, со стапка на екстракција од 80% -90%.Комплетот користи уникатна формула за процесот што го отстранува ендотоксинот, содржината на ендотоксинот е исклучително мала и ефектот на трансфекција на клетките е одличен.Извлечениот плазмид може директно да се користи во дигестија на ензими, PCR, транскрипција ин витро, трансформација, секвенционирање и други молекуларни биолошки експерименти.
Услови за складирање
RNaseA треба да се чува на -30 ~ -15 ℃ и да се транспортира на ≤0 ℃ .
Endotoxin Scavenger може да се чува на 2 ~ 8 ℃ за еден месец, да се чува на -30 ~ -15 ℃ за долгорочно складирањеи транспортирани на ≤0℃.
Другите компоненти треба да се чуваат на собна температура (15 ~ 25 ℃) и да се транспортираат на собна температура.
Компоненти
| Компоненти | 10 RXNS |
| RNase A | 750 μL |
| Бафер P1 | 75 мл |
| Бафер P2 | 75 мл |
| Бафер P4 | 75 мл |
| Чистач на ендотоксин | 25 мл |
| Бафер PW | 2 × 22 ml |
| Пуфер ТБ | 20 мл |
| Колони FastPure DNA Maxi (секоја во туба за колекција од 50 ml) | 10 |
| Цевка за колекција без ендотоксини | 2 × 5 |
RNaseA:10 mg/ml, што се користи за отстранување на РНК.
Бафер P1:бактериска суспензија пуфер, додадете RNaseA во пуфер P1 пред првата употреба.
Бафер P2:пуфер за лиза на бактерии (содржи SDS/NaOH).
Бафер P4:неутрализирачки тампон.
Чистач на ендотоксин:ефикасно го отстранува ендотоксинот од суровиот плазмиден екстракт.
Бафер PW:пуфер за миење, додајте го предвидениот волумен на етанол пред првата употреба.
Пуфер ТБ:пуфер за елуција.
Колони FastPure DNA Maxi:колони за адсорпција на плазмидна ДНК.
Цевки за колекција 50 ml:цевки за собирање филтрати.
Цевка за колекција без ендотоксини:плазмидни цевки за собирање на ДНК.
Подготвени материјали
Апсолутен етанол, изопропанол, 50 ml центрифуги со тркалезно дно и 50 ml без ендотоксиницевки за центрифугирање.
Апликации
Овој производ е погоден за големи екстракција на плазмиди од 150 - 300 ml бактериски растворкултивирани преку ноќ.
Процес на експериментирање
1. Земете 150 – 200 ml (не повеќе од 300 ml) бактериски раствор култивиран преку ноќ и центрифугирајте наоколу 11.000 вртежи во минута (12.000 × g) за 1 – 2 мин.Фрлете го супернатантот и соберете бактерии.
Δ Кога се собираат повеќе од 50 ml бактериски раствор, бактериите може да се соберат со додавање бактериски раствор, центрифугирање, фрлање на супернатантот и други чекори во истата епрувета од 50 ml за
повеќе пати.
2. Додадете 7,5 ml пуфер P1 (ве молиме проверете дали RNaseA е додадена во пуфер P1) во центрифугатацевка која содржи бактерии и темелно се меша со вител или пипетирање.
Δ Целосната ресуспензија на бактерии во овој чекор е од клучно значење за да се добие, и не треба да има бактериски купчиња по ресуспензијата.Ако има бактериски купчиња кои не се темелно измешани, тоа ќе влијае на лизата, што ќе резултира со низок принос и чистота.Ако OD600 на бактериски раствор е 0,65, се препорачува да се користат 7,5 ml пуфер P1 при екстракција од 150 ml бактериски раствор;кога OD600 е 0,75, треба да се користат 8 ml пуфер P1 и соодветно да се сменат волумените на пуферите P2 и P4.Доколку волуменот на бактерискиот раствор се зголеми на 200 ml, се препорачува да севолуменот на баферите P1, P2 и P4 да се зголемува пропорционално.
3. Додадете 7,5 ml пуфер P2 во бактериската суспензија од чекор 2 и нежно измешајте нагоре и надолу 6-8пати и инкубирајте на собна температура 4 – 5 мин.
Δ Нежно превртете го за да се измеша темелно.Вртењето ќе предизвика фрагментација на геномската ДНК, што ќе резултира со фрагменти од геномска ДНК во извлечениот плазмид.Во тоа време, растворот станува вискозен и проѕирен, што покажува дека бактериите се целосно лизирани.Времетраењето не треба да надминува 5 минути за да се избегне уништување на плазмидите.Ако растворот не е јасен, може да има премногу бактерии што резултиранецелосна лиза, па количината на бактерии треба соодветно да се намали.
4. Додадете 7,5 ml пуфер P4 во бактериската суспензија од чекор 3 и веднаш нежно превртете го 6 – 8 пати за да дозволите растворот целосно да го неутрализира пуферот P2.Во тоа време, треба да се појави бел флокулентен талог.Центрифугирајте со повеќе од околу 11.000 вртежи во минута (12.000 × g) 10 – 15 мин.аспирирајте го лебдечкиот бел талог.
Δ Додадете пуфер P4 и веднаш превртете го добро да се измеша.Оставете ја цевката да отстои додека белиот талог не се распореди рамномерно низ растворот за да се спречи создавање на локални врнежи што може да влијае на неутрализацијата.Ако не постои униформен бел флокулентен талог пред центрифугирањето и супернатантот не е чист по центрифугирањето, цевката може да сецентрифугира уште 5 мин.
5. Додадете 0, 1 пати поголем волумен (10% од волуменот на супернатантот, околу 2,2 ml) Endotoxin Scavenger во супернатантот од чекор 4 и превртете го за да се измеша.Ставете го растворот во ледена бања или вметнете го во кршен мраз (или замрзнувач) 5 минути додека растворот не се промени од матен во бистар и транспарентен (или миренмалку матно), и повремено се меша неколку пати.
Δ Откако ендотоксинскиот чистач ќе се додаде во супернатантот, супернатантот ќе стане заматен, носупернатантот треба да стане бистар (или малку заматен) по ладењето во ледената бања.
6. Откако супернатантот ќе се стави на собна температура (>25℃) 10 – 15 мин, ќе стане заматен каконеговата температура се зголемува до собна температура.Потоа супернатантот треба да се преврти за да се измеша.
Δ Ако собната температура е пониска или сакате да го намалите времето на екстракција, супернатантот може да се инкубира во водена бања од 37 ~ 42 ℃ 5 – 10 минути и следниот чекор може да се изврши по супернатантотстанува заматен.
7. Центрифугирајте го супернатантот на околу 11.000 вртежи во минута (12.000 × g) 10 мин на собна температура (температурата мора да биде >25℃) за да се оддели фазата.Горната водена фаза содржи ДНК, додека долната сина масна фаза содржи ендотоксин и други нечистотии.Пренесете гоВодена фаза која содржи ДНК до нова цевка иотфрлете го масниот слој.
Δ Температурата за време на центрифугирањето мора да биде над 25 ℃, бидејќи ефективно фазно одвојување несе јавуваат ако температурата е премногу ниска.
Δ Ако фазното одвојување не е ефективно, температурата на центрифугирање може да се прилагоди на 30℃ ивремето на центрифугирање може да се зголеми на 15 мин.
Δ Не го цицајте синиот мрсен слој бидејќи содржи ендотоксин и други нечистотии.
Механизам
Неутрализација на ресуспензија Лиза
◇ Додадете 7,5 ml пуфер P1
◇ Додадете 7,5 ml пуфер P2
◇ Додадете 7,5 ml пуфер P4
Отстранување на ендотоксин
◇Додадете 0, 1 пати поголем волумен на супернатантот на Endotoxin Scavenger
Врзување и перење
◇ Додадете 0,5 пати поголем волумен на изопропанол
◇ Додадете 10 ml пуфер PW
◇ Додадете 10 ml пуфер PW
Елуција
◇ Додадете 1 – 2 ml пуфер ТБ или ddH2O без ендотоксин
