M-MLV обратна транскриптаза
RevScript Реверзната транскриптаза се добива со технологија на генетско инженерство.Има поголема способност за синтеза на cDNA, термичка стабилност и ограничување на температурата на реакцијата (до 60°C).Синтетизираниот cDNA производ е до 10 kb.Го подобрува афинитетот на шаблоните и е погоден за обратна транскрипција на шаблони на РНК со сложена секундарна структура или гени со ниска копирање.
Компоненти
| Компонента | HC2003 Б (10.000 U) | HC2003 Б (5*10.000 U) | HC2003 Б (200.000 U) |
| RevScript обратна транскриптаза (200U/μL) | 50 μL | 5×50 μL | 1 мл |
| 5 × RevScript бафер | 250 μL | 1,25 мл | 5 ml |
Состојба на чување
Овој производ треба да се чува на -25°C~-15°C 2 години.
Дефиниција на единицата
Една единица вклучува 1 nmol dTTP во материјал нерастворлив во киселина за 10 минути на 37°C користејќи Oligo(dT) како прајмери.
Поставување реакција
1.Денатурација на шаблонот на РНК (Овој чекор е изборен, денатурацијата на шаблонот РНК помага да се отворат секундарните структури, што ќе го подобри приносот на cDNA на првата нишка.)
| Компоненти | Волумен (μL) |
| Слободна РНаза ddH2O | До 13 |
| Олиго (dT)18 (50 μmol/L) или случаен прајмер (50 μmol/L) Или генски специфични прајмери (2 μmol/L) | 1 |
| или 1 | |
| или 1 | |
| Шаблон за РНК | X a |
Белешки:
1) a: Вкупна РНК: 1-5 ug или mRNA: 1-500 ng
2) Инкубирање на 65°C 5 минути, а потоа веднаш префрлете го на мраз да се олади 2 минути.Кратка центрифугирање за да се собере реакционата течност, додадете го растворот за реакција на обратна транскрипција како што е прикажано во следната табела.Нежно пипетајте да се измеша.
1.Подготовка на реакционата смеса (20 μL волумен)
| Компоненти | Волумен (μL) |
| Мешавина од претходниот чекор | 13 |
| 5×Бафер | 4 |
| dNTP Mix (10nmol/L) | 1 |
| Реверзна транскриптаза (200 U/μL) | 1 |
| Инхибитор на RNase (40 U/μL) | 1 |
1.Направете ја реакцијата под следниве услови:
| Температура (°C) | Време |
| 25 °Ca | 5 мин |
| 42 °Cb | 15-30 мин |
| 85 °Cc | 5 мин |
Белешки:
1) а.Инкубацијата на 25°C за 5 минути е потребна само за користење на случајни хексамери.Ве молиме прескокнете го овој чекор кога користите Oligo (dT)18или Gene Specific Primer.
2) б.Препорачаната температура на обратна транскрипција е 42°C, за шаблони со комплицирани секундарни структури или висока содржина на GC, се препорачува да се подигне температурата на реакцијата на 50-55°C.
3) в.Греење на 85°C 5 минути за да се инактивира реверзната транскриптаза.
4) Производот може директно да се користи во PCR или qPCR реакции или да се чува на -20°C за краткорочно складирање.Се препорачува производите да се алигутираат и да се чуваат на -80°C за долгорочно складирање.Избегнувајте често замрзнување-одмрзнување.
5) Производот е погоден за едностепен RT-qPCR, се препорачува да се додаде 10-20 U реверзна транскриптаза за секој систем за реакција од 25μL или постепено да се зголемува количината на реверзна транскриптаза во согласност со фактичката ситуација.
Белешки
1.Ве молиме чувајте ја експерименталната област чиста;За време на работата треба да се носат чисти ракавици и маски.Сите потрошни материјали што се користат во експериментот треба да бидат без RNase за да се спречи контаминација на RNase.
2.Сите процедури треба да се изведуваат на мраз за да се спречи деградација на РНК.
3.Се препорачуваат висококвалитетни примероци на РНК за да се обезбеди висока ефикасност на обратната транскрипција.
4.Овој производ е само за истражувачка употреба.
5.Работете со лабораториски мантили и ракавици за еднократна употреба, за ваша безбедност.
