Комплет за директно PCR на растенијата

Бр. мачка: HCR2020A

Комплетот Plant Direct PCR е погоден за директно засилување на лисјата, семињата и сл., и може да се користи за високопропусен скрининг на растителни примероци кои не содржат полисахариди и полифеноли.Директната амплификација на ДНК полимеразата базирана на насочената еволуција има супериорна толеранција на PCR инхибиторите кај растенијата.Во меѓувреме, ги одржува високите перформанси на засилување, што е погодно за засилување на фрагменти на ДНК во рамките на 5 kb.Уникатниот Lysis пуфер А во комплетот може да се користи за лизирање на свежи или замрзнати растителни ткива.Лесно се ракува и лизатот може да се користи како шаблон за засилување без прочистување.Системот содржи заштитни средства кои овозможуваат ефикасно засилување на суровите примероци по повеќекратно замрзнување и одмрзнување.2 × Plant Direct Master Mix треба само да додаде прајмери ​​и шаблони за да се изврши реакција на засилување, а со тоа да се намалат операциите на пипетирање и да се подобри пропусната моќ на откривање и репродуктивноста на резултатите.

Компоненти

*Plant Direct Lysis Buffer B е опционален реагенс, кој се користи за неутрализирање на Plant Direct Lysis Buffer A за продолжување на времето на складирање на примероците.Може да се користи според фактичката ситуација.

Услови за чување

2 × Plant Direct Master Mix, складирајте на -30 ~ -15℃ и избегнувајте повеќекратно замрзнување и одмрзнување;Растителни пуфер за директна лиза, складирајте на -30 ~ -15 ℃ или 2 ~ 8 ℃.

Процес на експериментирање

Обработка на примероци-Растителен лист

Директен метод:Се препорачува да се користат млади листови.Користете дупчење со фиксен дијаметар од 0,5 – 3 mm за да добиете мала и униформа примерок, а потоа директно додајте ја мострата во системот PCR (се препорачува систем од 50 μl).Забелешка, проверете дали примерокот е во растворот за PCR, а не на ѕидот на цевката.Доколку се користи директна PCR за засилување на долги фрагменти и сложени примероци, користењето на примерок со помал дијаметар (0,5 – 1 mm) како шаблон може да помогне да се добијат подобри резултати.

Метод на лиза на мелење:Се препорачува да се користат млади листови.Земете мало парче лист (околу 1 – 3 mm во дијаметар), ставете го во 20 μl Plant Direct Lysis Buffer Ab и сомелете го колку што е можно повеќе (овој чекор може да се направи со стискање на листот со врв на пипета од 100 μl да се пасира примерокот) .Ако се користат поголеми количини на лиснато ткиво (не надминуваат 7 mm), зголемете го волуменот на пуферот за разредување на 50 μl.Откако листовите се мелени, растворот треба да изгледа зелено.По кратка центрифугирање, додадете 1 μl од супернатантот во PCR системот како образец за реакција.

Метод на термичка лиза:Се препорачува да се користат млади листови.Земете мало парче лист (околу 1 – 3 mm во дијаметар), ставете го во 20 μl Plant Direct Lysis Buffer A и загрејте го на 95°C 5 – 10 мин.Времето на лиза може соодветно да се продолжи за листовите кои тешко се лизираат (не повеќе од 20 мин).Ако се користат поголеми количини на лиснато ткиво (не надминуваат 7 mm), зголемете го волуменот на пуферот за разредување на 50 μl.По загревањето, кратко центрифугирајте и додадете 1 μl супернатант во PCR системот како шаблон за реакција.

Обработка на примероци- Растителни семиња

Метод на лиза на мелење:Користете скалпел за да исечете семиња со дијаметар од 5 mm, додајте ги во 100 μl од тампон А за директна лиза на растенијата и сомелете го примерокот со врв од пипета или други алатки.Завртете кратко и оставете да отстои на собна температура 3 – 5 мин.Проверете дали примерокот од семето е потопен во пуферот за разредување.По кратка центрифугирање, додадете 1 μl од супернатантот во PCR системот како образец за реакција.

Метод на термичка лиза:Користете скалпел за да исечете семиња со дијаметар од 5 mm, додајте ги во 100 μl Пуфер А за директна лиза на растенијата и загрејте на 95°C 5 – 10 мин.Времето на лиза може соодветно да се продолжи за листовите кои тешко се разложуваат (не повеќе од 30 мин).По загревањето, накратко се центрифугира и се додава 1 μl супернатант во PCR системот како шаблон за реакција.

а.Ножици или други алатки може да се користат и за сечење примероци со соодветна големина;ако перфораторот или ножиците се користат повторно, тие треба да се исчистат со 2% раствор на натриум хипохлорит пред секоја употреба за да се спречи вкрстена контаминација помеѓу примероците.

б.Уверете се дека пуферот за директна лиза на растенијата е целосно стопен пред употреба.Ако пуферот е вискозен или има талог, може да се загрее на 37℃ за да се стопи целосно пред употреба.

в.Волуменот на шаблонот во системот за реакција може соодветно да се прилагоди според разликата во волуменот на растителниот материјал и додадениот разредувач.

Фабрика за директна лиза пуфер

Пуферот за директна лиза на растенијата А содржан во овој производ е строго оптимизиран за ослободување на геномот на повеќето растителни ткива и е погоден за краткорочно складирање на сурови растенија на 4℃.Доколку примерокот треба да се чува подолг временски период (на пример, 1 – 2 месеци), се препорачува да се префрли супернатантот во нова EP цевка и да се чува на -20℃.За постабилно складирање на примероците, додадете еднаков волумен на Plant Direct Lysis Buffer B во пренесениот супернатант, добро измешајте и складирајте на -20℃.Стабилното време на складирање варира во зависност од примероците и состојбите на растенијата.

Систем за реакција

а.Содржи Mg²⁺при конечна концентрација од 2 mM.

б.Се препорачува да се користи конечна концентрација од 0,4μM за секој прајмер.Прекумерната употреба на прајмери ​​ќе доведе до зголемено неспецифично засилување.

в.Количината на употребената мостра може да се прилагоди според фактичката ситуација.Количината што се користи во една реакција на сурова лизирана мостра може да се прилагоди помеѓу 2% - 20% од вкупниот волумен на реакцијата.Користењето премногу примероци може да предизвика дефект на засилувањето.

Програма за реакција

а.Почетната денатурација (98℃, 5 мин) промовира лиза на растително ткиво, ослободувајќи геномска ДНК што може да се користи за PCR засилување.Не го скратувајте времето и не ја намалувајте температурата.

б.Се препорачува да се постави еднаква на вредноста на прајмерот Tm или 2 ~ 4℃ повисока од вредноста на Tm.Директната амплификација ДНК полимераза што се користи во овој производ е различна од конвенционалната Taq ДНК полимераза и има посебни барања за температурата на реакциско жарење; употребата на висока температура на жарење може ефикасно да го намали неспецифичното засилување и да ја подобри ефикасноста на засилување.За сложени шаблони, ефикасното засилување може да се постигне со прилагодување на температурата на жарење и продолжување на времето на продолжување.

в.Ако должината на производот за засилување е ≤1 kb, времето на продолжување е поставено на 30 секунди/kb;ако должината на производот за засилување е >1 kb, времето на продолжување е поставено на 60 секунди/kb.

г.За сложени примероци или примероци со низок принос на засилување, бројот на циклуси може соодветно да се зголеми на 40 -50 циклуси.

Апликации

Применливо е за директно засилување на растителни ткива и високопропусен скрининг на растителни примероци кои не содржат полисахариди и полифеноли.

Белешки

Само за истражувачка употреба.Не се користи во дијагностички процедури.

1. За сурово засилување на растенијата или директно засилување, се препорачува да се користи прочистена геномска ДНК како позитивна контрола пред да се започне со експериментот за да се осигура дека системот, прајмерите и операциите се точни.

2. Директната амплификација на ДНК полимеразата што се користи во овој комплет има силна коректорска активност.Доколку треба да се изврши ТА клонирање, се препорачува да се прочисти ДНК пред да се додаде аденин.

3. Упатство за дизајн на прајмер:

а.Се препорачува последната основа на 3' крајот на прајмерот да биде G или C.

б.Треба да се избегнуваат последователни несовпаѓања во последните 8 основи на 3' крајот на прајмерот.в.Избегнувајте структури на шноли на 3′ крајот на прајмерот.

г.Разликите во вредноста на Tm на предниот прајмер и на обратниот прајмер треба да бидат не повеќе од 1℃, а вредноста на Tm треба да се прилагоди на 60 ~ 72℃ (Се препорачува Primer Premier 5 за пресметување на вредноста на Tm).

д.Дополнителни дополнителни секвенци на прајмер што не се совпаѓаат со шаблонот, не треба да бидат вклучени при пресметувањето на вредноста на прајмерот Tm.

ѓ.Се препорачува содржината на GC во прајмерот да биде 40% -60%.

е.Целокупната дистрибуција на A, G, C и T во прајмерот треба да биде што е можно порамномерна.Избегнувајте користење на региони со висока содржина на GC или AT.

ч.Избегнувајте присуство на комплементарни секвенци од 5 или повеќе бази или во рамките на прајмерот или помеѓу два прајмери ​​и избегнувајте присуство на комплементарни секвенци од 3 или повеќе бази на 3' крајот на два прајмери.

јас.Користете ја функцијата NCBI BLAST за да ја проверите специфичноста на прајмерот за да спречите неспецифично засилување.